Jacques BOULAY
CLUB DROSERA DE METZ


LA CULTURE IN-VITRO
ET
SES APPLICATIONS A LA CULTURE
DES PLANTES CARNIVORES

(article de Jacques Boulay paru dans Dionée 28 en 1993)





LABORATOIRE DE BIOLOGIE DES LIGNEUX
UNIVERSITE DE NANCY 1

SOMMAIRE

Prologue.
Le milieu de culture. 1) Le petit matériel.
2) Composition des milieux.
3) Les régulateurs de croissance.
4) protocole de préparation.
Technique de la culture in-vitro. 1) Le matériel.
2) Travailler en conditions stériles a- Le plan de travail.
b- Stérilisation du matériel.
c- Stérilisation du matériel végétal.
d- La mise en culture.
e- Le travail en conditions stériles.
La micropropagation.
L'acclimatation.
Application à la culture des Plantes Carnivores.
 1) Les Droséras.
2) La Dionée.
3) Le Céphalotus follicularis.
4) Les Sarracénias.
5) Les Népenthes. a- A partir de bouturesDico.
b - A partir de graines.
Conclusion.
Remerciements.
Bibliographie.








Prologue


Un des projets initiaux du Club DROSERA de Metz a été l'application de nouvelles techniques de culture applicables aux Plantes CarnivoresDico.
Des essais sur orchidées effectués par Alexandre Antoine membre du club ont montré que les milieux de culture sont aisés à obtenir. Par contre le désinfectant nécessaire (l'hypochlorite de Calcium) ne se trouve plus couramment dans le commerce.
En proposant l'entretien d'une petite collection de Droséras à la Faculté des Sciences de Nancy Mr le Professeur Favre a fourni local et composants chimiques permettant la réalisation de notre projet.
Les essais ont porté sur les plantes suivantes :
  1. - Les Droséras.
  2. - La Dionée.
  3. - Le Cephalotus follicularis.
  4. - Les Sarracénias.
  5. - Les Népenthes


LA CULTURE IN -VITRO
ET
SES APPLICATIONS A LA CULTURE
DES PLANTES CARNIVORES.


Le milieu de culture. 1) Le petit matériel.
2) Composition des milieux.
3) Les régulateurs de croissance.
4) protocole de préparation.

Le principe de la culture in-vitro est de cultiver une plante en milieu nutritif. Ce milieu étant également favorable au développement des microorganismes qui est plus rapide que celui de la plante il convient de cultiver en conditions aseptiques c'est-à-dire en absence de tout microorganisme' L'asepsie est donc le problème majeur de ce mode de culture. C'est aussi son avantage : l'absence de germe favorise le développement et la multiplication de la plante qui se trouve dans des conditions "idéales".
Le milieu nutritif (ou base nutritive) doit fournir tous les éléments chimiques nécessaires au développement de la plante : carbone azote oligoéléments vitamines régulateurs de croissance etc...
Les milieux de culture sont de composition très précise Dans ce qui suit les milieux de KNUDSON et de MURASHIGE et SKOOG ont été utilisés à concentrations variables suivant l'espèceDico cultivée (cf. page 2)
Ces milieux nutritifs existent dans le commerce prêts à l'utilisation (cf. Bibliographie page 18). On peut aussi préparer soi-même des solution-mères concentrées qui seront diluées lors de l'emploi Ces solutions sont stables et se gardent très bien au réfrigérateur à 4°C de plus cette solution évite la perte de temps du pesage fastidieux des produits lors de la préparation.
A titre indicatif nous avons utilisé une solution-mère de KNUDSON concentrée 10X. Pour préparer un litre de milieu 100 ml sont prélevés à la pipette puis dilués à un litre avec de l'eau distillée.


1 ) Le petit matériel.



2) Composition des milieux.


Milieu de Murashige & Skoog M.S. (pour un litre de solution).
Ce milieu est la base de la composition de nombreux milieux de culture.

Macroéléments: NH4NO3 1,650 g.
KNO3 1,9 g.
CaCl2 H2O 0,44 g.
MgSO4 7 H2O 0,370 g.
KH2PO4 0,170 g.
Microéléments : H3BO3 6,2 mg.
MnSO4 4 H2O 22,3 mg.
ZnSO4 7 H2O 8,6 mg.
Kl 0,83 mg.
Na2MoO4 2H2O 0,25 mg.
CuSO4 5 H2O 0,025 mg.
CoCl2 6 H2O 0,025 mg.
Fer : FeSO4 7 H2O 2,78 g.
Na2 EDTA 3,73 g.



Milieu de culture pour Sarracénias : (pour un litre)
Macro M.S. 2/3 (dilué au 2/3)
Micro M.S. 1/1
Fer1/1
BAP 2,25 mg/l
AIB 0,2 mg/l
Saccharose 30 g/l
Agar 8 g/l pHDico= 5,7
Vitamines Linsmaier & Skoog :
Thiamine 0,4 mg/l
Myo-inositol 100 mg/l



Milieu de culture pour Droséras :
MacroM.S. 1/2
Micro M.S.1/1
Fer 1/1
Vitamines Linsmaier & Skoog :
BAP 0,5 mg/l
AIB 0,5 mg/l
Saccharose 30 g.
Agar7 g. pHDico = 5,7



Milieu de culture pour Céphalotus follicularis :
MacroM.S. 1/2
Micro M.S. 1/2
Fer1/1
Vitamines de Linsmaier & Skoog
BAP1 mg/l
AIB 0,1 mg/l
Saccharose 30 g/l
Agar8 g/l pHDico = 5,7



Milieu de KNUDSON. (Pour un litre de milieu)
Ca(NO3)2 4 H2O 1 g.
KH2PO4 0,25 g.
MgSO4 7 H2O 0,25 g.
(NH4)2SO4 0,5 g.
FeSO4 7 H2O 0,025 g.
MnSO4 4 H2O 0,0075 g.
Saccharose 20 g.
Agar 8 g.pHDico = 5



3) Les régulateurs de croissance.


L'existence des "hormonesDico végétales" a été découverte vers les années 30 (auxine) et 50 (gibbéréllines et cytokinines). Ces trois types de régulateurs ont une action stimulante sur la croissance du végétal. On en fabrique depuis artificiellement mais d'une efficacité variable. Une des applications sont les hormonesDico de bouturage du commerce.


Caractères communs à ces composés:


L'auxine (acideDico indole acétique -AIA- ) :
Son action physiologique varie suivant sa concentration et son interaction avec les autres hormonesDico . En général elle intervient :


Les gibbérellines :
Les gibbérellines sont un ensemble d'hormonesDico présentant chacune le même type d'action mais à capacité variable. Il convient donc de se renseigner sur les propriétés précises des gibbérellines que l'on souhaite utiliser.


Les principales propriétés appliquées à la culture in-vitro sont les suivantes:


Les cytokinines :
Elles sont très actives et présentent de nombreuses actions :



En résumé selon SKOOG le comportement physiologique d'un explant mis en culture serait le suivant:



4) Protocole de préparation des milieux.
  1. Dans une fiole jaugée préparer la solution de macro et de micro éléments.
  2. Ajouter les régulateurs de croissance.
  3. Compléter la fiole et verser le contenu dans le ballon.
  4. Ajouter le saccharose et le dissoudre.
  5. Vérifier le pHDico et l'ajuster avec quelques gouttes de soude pour l'élever ou d'acideDico chlorhydrique pour l'abaisser.
  6. Chauffer et verser petit à petit la gélose tout en remuant afin d'obtenir une solution homogène.
  7. Sitôt que la solution devient bouillonnante la retirer du chauffe-ballon et laisser refroidir jusque 60°C environ.
  8. A ce moment là couler le milieu encore chaud dans les bocaux.
  9. Autoclaver.




Technique de la culture in-vitro.
 		1) Le matériel.
2) Travailler en conditions stériles a- Le plan de travail.
b- Stérilisation du matériel.
c- Stérilisation du matériel végétal.
d- La mise en culture.
e- Le travail en conditions stériles.
1) Le matériel.


Voici une liste non exhaustive du matériel qu'il est conseillé d'avoir:
Accessoires et produits :

Composition d'une boîte de manipulation : (le matériel doit pouvoir être stérilisé) La verrerie de la mise en culture :
Le choix dépend :



Si on introduit des graines, des boites de pétri suffisent jusqu'à la germination. Ensuite on repique les jeunes plantsDico dans des récipients plus grands (bocaux tubes à essai).


Si on cultive des plantes, on peut utiliser les tubes à essai (de diamètre 25 mm ) ce qui évite la propagation de contaminations puisque chaque plantDico est isolé, ou des bocaux type "Le Parfait" (bocaux à confiture), l'avantage étant un gain de place quand on a beaucoup de plantsDico ; si la manipulation est bien faite, il n'y a aucune raison pour qu'il y ait une contamination. De plus le volume d'air étant plus grand la plante se développe mieux.




2) Travailler en conditions stériles a- Le plan de travail.
b- Stérilisation du matériel.
c- Stérilisation du matériel végétal.
d- La mise en culture.
e- Le travail en conditions stériles.


La stérilité est la clef de la réussite de la culture in-vitro. Cela demande beaucoup de rigueur.


a- Le plan de travail.


Le choix de l'emplacement est important : il doit se trouver à l'abri des courants d'air, des endroits trop fréquentés (le passage créant des déplacements d'air).


Le support du plan de travail doit être plan, lavable à l'eau de javel si possible. Il est possible de se faire un plan de travail avec une planche de Novopan d'environ 1m2 carrelée comme une paillasse de laboratoire. Le plan doit se trouver dans un endroit bien éclairé.








b- Stérilisation du matériel.
La stérilisation a pour but de tuer tous les micro-organismes pouvant contaminer les cultures. Elle se fait selon plusieurs modes.


c- Stérilisation du matériel végétal. Les semences
Les boutures et les bourgeons


 Les semences :


La stérilisation des semences est une opération très délicate car elle consiste à plonger les graines dans un désinfectant très agressif. Si le bain est prolongé, celui-ci risque d'attaquer le cortex et de tuer la graine. Par contre si le bain est trop court, la désinfection n'est pas complète et lors de la mise en culture, les microorganismes se développeront.

Lorsqu'on a un lot de graines à mettre en culture, il vaut mieux diviser ce lot en plusieurs; un à semer in-vivo afin de s'assurer de la viabilité des graines, les autres à mettre en culture séparément au cas où une erreur se serait glissée dans la manipulation afin qu'elle ne puisse pas condamner le lot entier de graines.

Principe général de désinfection :

La durée des bains varie selon le type de graine et la concentration du désinfectant : plus la concentration en hypochlorite est forte plus le temps de passage dans la solution de désinfectant doit être court. De même, plus la graine est fragile comme celle du Népenthes, plus la concentration du désinfectant devra être faible et la durée d'immersion courte.


La préparation de l'hypochlorite de calcium :


Suivant la graine la concentration peut aller de 1 à 10% c'est-à-dire de 1 à 10 grammes d'hypochlorite pour 100 ml d'eau distillée. L'hypochlorite étant peu soluble dans l'eau il faut bien mélanger la poudre dans l'eau distillée puis filtrer la suspension. On obtient alors un liquide jaune qu'il faudra utiliser dans la demi-journée. La solution d'hypochlorite doit donc se préparer avant chaque séance de désinfection et ne se conserve pas. Pour nettoyer la verrerie il suffit de la rincer dans de l'acideDico chlorhydrique dilué pour précipiter les traces blanches de l'hypochlorite.


Le rinçage dans de l'eau distillée stérilisée n'est pas absolument nécessaire. En effet si la concentration en gélose du milieu de culture est relativement faible (environ 6 g/l ) on peut observer une fine pellicule d'eau à la surface du milieu. Dans ce cas cette eau parfaitement stérile servira d'eau de rinçage. Cela évite une manipulation supplémentaire donc un risque de contamination supplémentaire.


- Les bouturesDico et les bourgeons.


Théoriquement c'est possible mais il faut un temps de désinfection beaucoup plus long et une concentration en hypochlorite beaucoup plus forte.


Après le rinçage, il faut couper les extrémités brûlées par l'hypochlorite avant de les mettre en culture. Cependant il faut s'attendre à beaucoup de pertes en contaminations car il est très probable que l'intérieur du végétal soit contaminé. Dans ce cas, il n'y a rien à faire.


N'ayant pas encore essayé je ne peux rien dire sur le prélèvement de méristèmes. Tout ce qu'on peut dire c'est que cela demande du matériel (au moins un bon microscope) ; le prélèvement de cellules méristématiques est très délicat car elles se dessèchent très vite. Il faut donc les maintenir dans un milieu humide, opération difficile autour d'une flamme qui dessèche l'air. De plus les risques de contamination sont grands donc les pertes de matériel végétal importantes. En ce qui concerne les plantes carnivoresDico , notamment les Nepenthes, il est dommage d'en perdre autant alors qu'on a plus de chance de les réussir in-vivo.


d- La mise en culture.


Une fois stérilisé, le matériel végétal est déposé sur le milieu de culture. La mise en culture est une manipulation qui se fait en conditions stériles.


La salle de culture est composée d'étagères surmontées de tube néon de type "Gro-Lux". Il y règne une température constante de 25°C et un rythme d'éclairement de 14 heures par jour.








e- Le travail en conditions stériles. La flamme
La hotte à flux laminaire
Organisation du plan de travail


 La flamme.
Les manipulations se font autour d'une flamme d'un réchaud à alcool ou d'un bec Bunsen. Le principe est le suivant (Fig. 1):


Fig. 1 : Création d'une atmosphère stérile.


La chaleur que dégage la flamme crée un courant d'air chaud ascendant qui empêche les micro-organismes de se déposer. Il en résulte une sphère stérile d'environ 10 à 15 cm de rayon où on pourra manipuler. Lors des premières tentatives de manipulation, s'entraîner à étudier chaque geste calmement de façon à avoir des gestes précis sans se brûler.


On peut préparer le plan de travail suivant (Fig. 2) :


Fig. 2 : Plan de travail avec atmosphère stérile.


En manipulant entre les deux flammes, on est sûr d'avoir une atmosphère stérile sans être gêné par 1a crainte de se brûler. Mais attention, les explants dessèchent vite à la chaleur.




La hotte à flux laminaire.


Elle n'est nullement indispensable pour une culture in-vitro en amateur. Le principe est le suivant (Fig 3) :


Fig. 3 : Schéma d'une hotte à flux laminaire.


L'air est stérilisé par filtration et passage sous U.V.. Il ressort en flux régulier qui crée une atmosphère stérile.


Néanmoins le travail à la flamme demeure indispensable, même sous une hotte.






Organisation du plan de travail.
Voici dans l'ordre les principales manipulations à effectuer :
  1. Désinfecter le plan de travail soit à l'alcool à 70° soit à l'eau de Javel. Pour plus de sûreté on peut placer un grand papier Buvard imbibé d'eau de Javel diluée.
  2. Avoir à sa portée tous les instruments de travail de façon à avoir le moins de grands gestes à faire au cours de la manipulation (les grands mouvements entraînent des déplacements d'air donc des risques de contamination).
  3. Se laver les mains, les rincer à l'alcool à 70°. Attention, attendre que l'alcool se soit évaporé avant d'approcher les mains de la flamme.
  4. Disposer ses instruments stérilisés de façon à les avoir dans l'aire stérile, et le reste à sa portée.


Entre chaque manipulation, ne pas oublier de désinfecter systématiquement les instruments.




III-La micropropagation.
La micropropagation consiste à faire des repiquages sur différents milieux. Si le but est la multiplication, le milieu peut alors contenir des régulateurs de croissance. Cela n'est pas nécessaire; personnellement j'en utilise rarement, les plantes se multipliant très bien en leur absence.
Si on souhaite la formation de cals les hormonesDico sont conseillées. Dans ce cas on obtient des amas de cellules indifférenciées à partir desquels croissent des plantulesDico . Pour une multiplication à grande échelle ceci est intéressant. En général, il est conseillé de repiquer dans un milieu neuf tous les deux mois environ. On en profite pour ôter les feuilles mortes, les cals indésirables, sélectionner les meilleurs plantsDico , diviser les touffes changer de milieu...
L'intérêt de la culture in-vitro est que les bouturesDico à partir de feuilles ou de pièges réussissent pratiquement à 100% alors qu'elles sont aléatoires en culture in-vivo.
Si le repiquageDico n'est pas fait régulièrement, on risque de constater deux choses :



IV- L'acclimatation.
L'acclimatation consiste à transplanter le vitro-plant dans le milieu ambiant.
Voici quelques conseils pour réussir :
Le risque d'échec est grand lorsque le vitroplant a été maintenu trop longtemps in-vitro. C'est le cas pour Byblis gigantea qui est multiplié in-vitro au laboratoire depuis des années et qui dépérit à chaque tentative d'acclimatation.




V- Application à la culture des Plantes CarnivoresDico . 1) Les Droséras.
2) La Dionée.
3) Le Céphalotus follicularis.
4) Les Sarracénias.
5) Les Népenthes. a- A partir de bouturesDico .
b - A partir de graines.



1) Les Droséras.


Milieu utilisé : M.S. ( Macro 1/2 et Micro 1/1 )


Les Droséras se multiplient très bien in-vitro, presque trop bien, car rapidement on se retrouve avec un amas de rosettesDico qu'il faut sélectionner lors du repiquageDico . C'est un excellent matériel d'entraînement pour le repiquageDico , le bouturage, et toutes les manipulations in-vitro.


De plus toutes les Droséras s'acclimatent facilement. On peut remarquer la D. binata qui, cultivée in-vitro, ne développe pas sa fourche mais reste sous forme de tige avec une fourche avortée. Elle se multiplie très bien par division de touffes. Lors de l'acclimatation, elle se remet à développer sa fourche. C'est un cas intéressant quoique peu généralisable car les autre Droséras développent de magnifiques rosettesDico . Est-ce la richesse du milieu qui entraîne l'avortement des pièges? Pour pouvoir répondre, il faudrait tester différentes concentrations et différents milieux de culture.




2) La Dionée.
Une autre plante qui se multiplie très bien est la Dionée. Elle croit très bien in-vivo, mais elle n'en reste pas moins fascinante in-vitro. L'unique avantage à ce niveau est la rapidité de croissance et la facilité de multiplication végétative. Les graines venaient de la récolte Printemps-Eté 91 de Mr Didier Vasseur. Semées courant janvier, les premières germinations sont apparues une dizaine de jours après.
Le protocole suivant a été appliqué :
Remarque : il est conseillé de ne pas suivre les temps exacts; c'est à chacun d'essayer avec différents lots de graines des temps variant autour des durées citées.
Obtention de 47% de germination.
La croissance est spectaculaire. On n'assiste pas à la formation d'un pseudobulbe comme dans la nature, mais comme dans ces milieux aseptiques rien ne meurt, il se forme une véritable chaîne de feuilles avec chacune une racine. Les graines ayant été placées initialement dans des tubes, ceux-ci sont vite devenus trop étroits et j'ai dû les repiquer dans des bocaux C'est alors qu'on divise la plante, en sectionnant la "chaîne" avec un scalpel. La "chaîne" est facile à voir: chaque étage est constitué d'un piège, d'une feuille, d'une racine. Il suffit de couper entre deux étages. Ainsi à partir d'une graine on peut obtenir trois à quatre plantsDico dès le premier repiquageDico .
Si on laisse les dionées dans un milieu trop riche, les parties immergées dans la gélose se transforment en cals et une multitude de petites dionées de 5 mm de haut environ se développent. C'est une expérience intéressante; s'il vous reste un bocal inoccupé, placez-y des feuilles ou des pièges que vous aurez prélevés lors d'un repiquageDico . Il faut que le milieu ne soit pas trop "agressif", le risque étant que les bouturesDico deviennent toutes rouges et finissent par dépérir.
En octobre 92, soit 9 mois après avoir semé les graines, j'ai obtenu quelques rosettesDico qui atteignent 7 à 8 cm de diamètre, ainsi qu'une multitude de dionées issues de cals.
L'acclimatation se fait sans problème, quelque soit la taille de la Dionée, suivant le protocole du chapitre IV.






3) Le Cephalotus follicularis.
Ne trouvant pas de graines, je me suis procuré des vitroplants de Céphalotus et les ai repiqués sur milieu M.S. (Macro 1/2, Micro 1/2, BAP 1 mg/l, AIB 0,1 mg/l).
Les vitroplants étaient répartis en six bocaux, contenant une vingtaine de pieds chacun. les pieds ayant 10 à 15 mm de haut avec de petits pièges de 3 mm environ. Le but des essais était d'obtenir des cephalotus de grande taille avec des pièges d'au moins 3 cm.
Or le Céphalotus, lorsqu'il est cultivé in-vitro, a plus tendance à se multiplier qu'à grandir. En fin d'été, la division des touffes et la séparation des pieds ont nécessité deux jours de travail, et ont permis de remplir en entier 30 bocaux de Céphalotus d'environ 15 mm. Par ailleurs l'acclimatation d'un demi-bocal a donné trois terrines à acclimater; ce qui a été fait sans difficulté particulière dans les conditions suivantes :


Aucun plantDico n'a dépéri, mais ceux se trouvant dans le terrarium paraissent plus vigoureux.
Quant aux 30 bocaux, ils ont été répartis suivant cinq milieux:
On constate une forte induction racinaire dans le lot n°5, une formation moindre pour le lot n°4, et pas de formation de racine pour les autres lots.
La taille des plantes est sensiblement la même pour tous les milieux.
Autre constatation : généralement je ferme hermétiquement le bocal en scellant le couvercle avec du parafilm afin d'éviter que l'on soulève le couvercle. Cette fois-ci, un couvercle de chaque groupe est resté non scellé, le couvercle uniquement maintenu par deux morceaux de ruban adhésif.
Il n'y a pas eu de contamination, mais les plantes poussant dans les bocaux non hermétiquement fermés présentent une couleur verte beaucoup plus foncée que les autres plantsDico et semblent beaucoup plus vigoureuses.
Le fait de ne pas mettre de parafilm a permis un échange d'air avec l'extérieur. L'absence de contamination est dûe au fait que l'air est filtré en passant entre le couvercle et le bocal.
Quelques soient les milieux, les Céphalotus ont présenté des pièges.





4) Les Sarracénias.


Pour l'instant, peu de graines ont germé. Il faut sûrement respecter leur période de repos au froid avant de les mettre en culture. Par contre, on peut admirer de magnifiques pieds de S. purpurea au Jardin Botanique de Nancy. Ils proviennent de germinations in-vitro. Apparemment, le fait que la germination soit in-vitro donne aux jeunes plantes une plus grande vigueur.



5) Les Népenthes.


Les essais ont été effectués à partir de boutures et de graines.


a- A partir de bouturesDico ( Février 92 )
A l'occasion d'une taille de plusieurs espècesDico de Nepenthes, une introduction primaire a été effectuée : elle consiste à introduire in-vitro des bouturesDico de Népenthes de 5 à 6 cm contenant un à deux noeuds. 24 bouturesDico ont été effectuées. Le gros problème a été la décontamination qui, pour rappel, est beaucoup plus difficile que dans le cas des graines.
Voici le protocole suivi :
Des 24 bouturesDico , 2 seulement ont donné des résultats. Il s'agit de N.gracilis. dont 1 boutureDico fut gardée in-vitro, l'autre fut acclimatée dés l'apparition de la première feuille.



b- A partir de graines ( Avril 92 ).
Les graines doivent être de première fraîcheur pour obtenir un maximum de germination.
Les graines reçues sont des graines de N. kampotiana et de N. gracilis. La répartition fut la suivante :
Résultats :
En aucun cas les graines de N. gracilis, qui pourtant à la réception paraissaient de meilleure qualité, n'ont germé.
Les N. kampotiana mis en semis 2 semaines après réception n'ont pas dépassé un diamètre de 1cm. Par contre sur 30 semis faits dès la réception : Quant à la culture in-vitro de N. kampotiana, presque toutes les boites de pétri ont été contaminées non par manque de désinfection mais du fait que les graines étaient contaminées de l'intérieur. Après repiquages sélectifs une boite de pétri a été isolée. Les premières germinations sont apparues après un mois et demi Après 7 mois et demi, les vitroplants sont très vigoureux et certains ont un diamètre compris entre 8 et 10 cm.



VI- Conclusion.
La culture in-vitro permet plus facilement des multiplications végétatives, et est tout aussi passionnante que la culture in-vivo. Mais la préparation des milieux, le coût des installations, la rendent relativement onéreuse. Par ailleurs, l'acclimatation nécessaire est aussi une contrainte. Ainsi on a vu que si elle est facile pour la Dionée, elle est très délicate pour Byblis gigantea.


Les cultures in-vitro effectuées ont montré pour les Droseras, les Dionées et le Céphalotus follicularis une multiplication végétative particulièrement efficace. Quant au Népenthes, des difficultés sont apparues du fait d'une contamination interne des graines et des bouturesDico . Néanmoins, des résultats satisfaisants ont été obtenus à partir de repiquages sélectifs. On a pu constater que la fraîcheur des graines est un facteur de première importance.


Rappelons enfin que la culture in-vitro est utilisée commercialement pour la production rapide à grande échelle ainsi que pour la récupération d'espècesDico malades dont on cultive les cellules méristématiques afin de produire des plantes saines.


Remerciements.


Je tiens à remercier tout particulièrement MM les Professeurs J.M. FAVRE et J. DEXHEIMER et toute l'équipe du Laboratoire de Biologie des Ligneux pour leurs précieux conseils ainsi que M. B. CUNIN du Jardin Botanique de Nancy, M. J. PIQUEE de l'Ecole d'Horticulture de Roville-aux-Chênes, l'Association DIONEE, tous mes amis du Club DROSERA, M. M. LECOUFLE et tous ceux qui ont participé à la présentation de cet article.








Bibliographie.